山蛩提取物对小鼠移植性肿瘤的影响
中国中医研究院中药研究所药理室肿瘤组
姜廷良
严述常
王素芬
冯桂文
李兰芳
武桂兰
河南省南阳地区民间流传用山蛩治疗食管癌。<本草纲目>记载它“有大毒”,可“烧黑,傅恶疮”(1)。我们在采风的基础上对它进行了动物实验，它的提取物对小鼠某些移植性肿瘤生长有一定的抑制作用,且毒性不大，现将结果报导于下。
一、抗肿瘤作用
(一)材料和方法
1、药物:
所用的动物采自河北省磁县。经中国科学院动物研究所鉴定系山蛩科山蛩目动物山蛩虫(Spirobolus
budgii Brandt)。取活的山蛩,杀死,晒干,粉碎,用水、乙醚、乙醇提取,分别制成水提取物、醚提取物和醇提取物的乳剂,灭菌后冰箱保存,供动物实验用。制剂浓度按每毫升所含提取物的重量计算。使用一般不超过一个月。所用制剂均由本所化学室提供。
2、动物:
用本院饲育的18--22克体重的昆明种小鼠或本组繁殖的6周龄C57BL系小鼠,雌雄各半,给予本院配制的固体饲料和自来水,自由取食。
3、瘤株:
系本组在动物上长期移植传代的小鼠实体型宫颈癌(U14)、肉瘤(S37)、肺癌(Lewis)和腹水型宫颈癌(U14A)、肉瘤(S180A)、艾氏腹水瘤(ECA)。
4、方法:
实体瘤,
选移植10--12天生长良好的瘤块,用冰冷生理盐水,按1:4~6(重量/容积)比例,于组织研磨器中制成无菌瘤组织悬液,经滤血网过滤,接种在小鼠右前肢皮下,每只0.1~0.2毫升。接种后次日随机分组,每组10~20只。给药组腹腔给予适当浓度的药液0.2毫升,对照组给予等容积的溶媒,每天一次,14天后处死动物,剖出瘤块，称重，按全国抗肿瘤药物协作会议制订的规定(2）,计算肿瘤生长抑制率,进行t测验。
腹水瘤,
选移植5~7天生长良好的癌性腹水液,经活体染色,计数,除外死细胞,用冰冷生理盐水稀释到适当浓度,每鼠腹腔注射0.2毫升(含3~4×106个活瘤细胞)。接种次日,随机分组,腹腔给药,对照组给等容积溶媒。7天后杀死动物,测定每只小鼠的腹水量和活瘤细胞总数,按类似肿瘤生长抑制率的计算方法,算出抑制率;若小鼠腹腔中未发现腹水，作为肿瘤“未发”，以肿瘤未发数除以全组动物数,算出肿瘤未发率,与对照组作x2处理。为了观察对荷腹水瘤动物的生命延长率,于腹腔接种瘤细胞后,逐日记录它们的自然死亡时间,观察一个月,计算平均存活天数,进行组间比较。存活超过一个月者,统计时作30天计。
(二)
实验结果
1、 对实体瘤生长的抑制作用:
从表1可以看出,山蛩的醚提取物、醇提取物对小鼠宫颈癌(U14)的生长均有一定抑制作用。醚提取物剂量在0.15~0.50克/公斤/天范围内,连续给药12~14天,肿瘤生长抑制率为30.4~41.2﹪;醇提取物剂量在1.2~1.3克/公斤/天时,连给12~14天,肿瘤生长抑制率为29.1~41.1﹪;水提取物虽用到动物最大耐受剂量,但不表现任何抑瘤作用。醇醚提取物对U14有一定抑瘤效果外,对Lewis肺癌生长也有较显著的抑制作用,认0.2克/公斤/天连给14天,肿瘤生长抑制率达59.8﹪；但同样剂量对肉瘤S37生长则无明显影响。
2、 对腹水瘤生长的抑制作用：
从表2中可以看出,山蛩的醇、醚和醇醚提取物对U14A生长均有显著的抑制作用。醚提取物0.15克/公斤的剂量,可使25~47﹪的动物不出现癌性腹水(在所有对照组动物中,除个别实验仅有1只不出现癌性腹水外,其余均长成典型腹水瘤),腹水形成量的抑制率在52~77﹪之间,瘤细胞数的抑制率为80~90﹪。醇提取物用0.6或0.9克/公斤剂量,可使78﹪和45﹪的动物不出现癌性腹水,腹水形成量抑制率为84﹪和80﹪,瘤细胞数抑制率为98﹪和93﹪；对S180A和ECA瘤株也有相似效果。醇醚提取物在0.05~0.2克/公斤的剂量范围内,对U14A生长的抑制作用随着剂量增加而增强。0.05克/公斤时,肿瘤未发率平均为34﹪,0.1克/公斤时为65﹪,0.2克/公斤可使全部动物不出现癌性腹水。
3、对荷腹水瘤(U14A)小鼠存活时间的影响,以山蛩醇醚提取物0.2克/公斤剂量,每天连给腹腔接种了3.75×106个U14A癌细胞的小鼠,共9次,能显著延长动物的存活时间。对照组动物在15天内全部死亡,平均存活时间12.0±0.4天；给药组动物观察1个月,仍有42﹪的动物存活,未见腹水瘤生长,平均存活时间24.8±2.5天,生命延长率达107﹪。以同剂量只给药一次,或隔日一次,共3次或连续给药6次
,也能明显延长荷瘤小鼠的生命,1个月时的生命延长率分别为55﹪,77﹪和63﹪。与对照组相比,统计学上均具有非常显著的差异。
二、毒性试验
鉴于<本草纲目>指出,山蛩“有大毒”,我们用其醇醚提取物对小鼠和狗作了毒性试验观察。
(一)
急性毒性试验
接受大量药物的小鼠,均蜷曲少动,趾爪表皮温度下降,呼吸频率减少,呈抑制状态;随着抑制程度的加深,最后导致死亡。用18~21.5克体重的雄性昆明种小鼠,于室温19°C,中午12点30分腹腔一次给药,观察3天,以补插法求得的半数致死量(LD50)为2.773±0.156克/公斤体重。
(二)
亚急性毒性试验
用23~24克体重的昆明种小凯,雌雄各半,每组10只,分别皮下注射山蛩醇醚提取物0.4、0.2和0.1克/公斤/天,每天一次,连续26天(对照组20只,给等容积溶媒),观察给药前、给药过程中和实验结束时的小鼠体重增长、外周血象等变化。无论是大剂量、中剂量或小剂量组,它们的体重增长曲线与对照组没有明显差异;外周血白细胞数和血色素变化也与对照组基本相同(3)。
杀剖所有动物,计算各剂量组和对照组的心、肝、脾、肺、肾等重量系数(脏器重量克/100克体重)。从表3可以看出,各剂量组和对照组的心、脾、肺、肝、肾等系数无显著差异,病理检查表明,各给药组动物的心、脾、肝、肾、肺脏未见药物引起的改变。
以12.5~17.3公斤的狗6条,分别皮下注射0.2或0.1克山蛩的醇醚提取物,每日一次,连续2天,检查给药前、给药第22天和第28天时的体重,未见明显变化;外周红、白细胞数和血色素值以及血清谷丙转氨酶活性也均在正常范围内波动。对接受不同剂量药物狗的心、肝、脾、肾、肺组织作病理检查,与对照组狗无明显差异。
三、
讨论
山蛩,在<本草纲目>中称为山蛩虫,谓烧黑外敷能治“恶疮”。祖国医学所称的“恶疮”,和“症瘕积聚”、“石茧”、“失荣”等一样,有些即属现今的恶性肿瘤。因此,山蛩在明代可能己作为一种外用治癌药在群众中应用。最近,有人报道用与山蛩虫相类似的马陆对皮肤癌也有某些疗效(4)。我们在采风基础上进行了动物试验,发现山蛩的醇、醚或醇醚提取物对小鼠移植性实体型宫颈癌和肺癌有一定抑制作用,也可以抑制腹水型宫颈癌、肉瘤千门艾氏腹水瘤的生长,并能延长荷瘤小鼠的存活时间。在较高剂量时,甚至完全阻断腹水瘤形成。为了比较山蛩醇提取物与化学药物氟脲嘧啶的抑瘤效果,我们曾作了一项初试:用20~24克体重的昆明种小鼠,腹腔接种0.48×106个U14A癌细胞,次日起分组同途径给山蛩醇提取物300毫克/公斤/天或氟脲嘧啶1.56~12.5毫克/公斤/天,每天一次,共6次,杀剖动物检查肿瘤生长情况,以瘤细胞抑制率推断300U14克/公斤山蛩醇粗提取物的抑瘤作用接近于10毫克/公斤的氟脲嘧啶。以上情况说明,山蛩提取物具有一定的抗肿瘤活性,是一个值得进一步研究的药材。
李时珍指出,山蛩虫有大毒。但我们在采集药材过程中,除个别人接触后曾引起皮肤过敏外,未见其它不适。用其醇醚粗提取物所作的急性毒性试验表明,小鼠的半数致死量(腹腔)为2.773克/公斤,LD5为2.01克/公斤,抗实验肿瘤的安全界在10以上。
四、
小结
山蛩的醚、醇和醇醚提取物对小鼠某些移植性肿瘤生长有一定的抑制作用。醚提取物能抑制实体型和肺癌和腹水型U14的生长，醇提取物能抑制实体型U14和腹水型U14A、肉瘤S180A、艾氏腹水瘤的生长；醇醚提取物能抑制实体型U14、Lewis肺癌和腹水型U14的生长,能延长荷瘤(U14)小鼠的存活时间。山蛩的醇醚提取物安全界在10以上。
参考文献
(1)
李时珍:本草纲目卷42。
(2)
全国抗肿瘤药物研究协作会议:抗肿瘤药物体内筛选规程。
(3)
中国中医研究院中药研究所药理生化组:连续动态观察单只小鼠血液生化指标的超微量测定方法。内部资料。
(4)
四川医学院附属口腔医院颌面外科:复方千足虫膏治疗皮肤癌35例临床观察。
本文发表于《中医杂志》1980年第六期59页
山蛩提取物对瘤细胞作用的观察
中国中医研究院中药研究所药理室肿瘤组
姜廷良 冯桂文 李兰芳 沈建华
傅湘琦
ABSTRACT
Mice with ascites U14
carcinoma were trated (ip. 200mg/kg for once
only )with the extract of Spirobolus bungii Brandt.
An increase in cancer cell death ratio of 35﹪ was
seen at 2 hr . after treatment. The injured cells
presented karyopyknosis, karyoclasis, cytoclasis and
vacuolization. Tumor nitosis was immediately
arrested. After up to 24 hr. of exposure, the ratio
of mitosis fell below the starting level. Scanning
electron microscopy also revealed significantchanges.
The plasma membrane of cancer cell appeared
deepening of gap, increasing in small fingerilike
processes and rising of large granules. The findings
indicated that the extract had direct destructive
effect on cancer cell.The activity happened at l hr.
after single treatment and lasted for 6 hours.
我们观察到,山蛩(SPirobolus bungii
Brandt.)提取物对小鼠某些实体瘤和腹水型移植性肿瘤生长有一定的抑制作用,特别对腹水型肿瘤,用对实体瘤有效剂量的1/4~1/6,甚则一次腹腔给药,就有显著抑制癌细胞增植和延长动物存活时间的作用,提示山蛩提取物对癌细胞可能具有直接损伤作用。为此，我们用组织学和扫描电镜方法,观察了它对癌细胞的作用。
一、 对癌细胞一般形态学的影响
用本院饲育的20~22克体重昆明种小鼠,雌雄不拘,腹腔接种活的腹水型移植性宫颈癌(U14A)细胞4~5×106个/只,5天后,选择腹水癌生长大体相同的动物,按体重随机分为2组,每组8~10只。给药组腹腔给予山蛩醇醚提取物0.2毫升(200毫克/公斤)一次,对照组给予等容量溶媒。在给药前和给药后第1、2、6和12小时,分别穿刺腹腔,用无菌注射器吸取腹水液0.1毫升,涂片,Geimsa染色,微镜检查观察。
给药前生长5天的癌性腹水涂片,视野中可见大量生长旺盛的癌细胞。癌细胞呈圆形或卵圆形,大小不均。胞浆嗜碱性较强,核大,约占整个细胞的3/4左右,染色深。可看到多核巨瘤细胞,细胞分裂相多见,偶可见中性粒细胞和大单核细胞。
给药后1小时,涂片上大量癌细胞形态发生改变：有些核基本正常的癌细胞膜,发生凸起;有些膜、浆基本保持正常的癌细胞核裂解,染色质呈球、块状，染色变浅;有些较少癌细胞则完全溶解。给药后2小时,涂片上满视野均为核裂解或完全溶解的癌细胞,很难找到“正常”的癌细胞。这种现象在给药后6小时的涂片上依然如此。给药后12小时,涂片上溶解的癌细胞己经基本消失,可见到较多的嗜中性粒细胞和大单核细胞,偶尔亦可发现个别残存的癌细胞。给溶媒的对照组小鼠,癌性腹水液涂片的细胞,无论在处理后1小时、2小时、6小时或12小时,均与处理前无明显差异。
结果提示,山蛩的醇醚提取物,可以损伤破坏癌细胞,使癌细胞核裂解、溶解,在给药后1小时即呈现明显作用,作用持续6小时以上。
二、
对癌细胞红染率的影响
癌细胞红染率是用活体染料伊红溶液观察癌细胞染色的情况。当活体癌细胞膜功能完整时,能排斥染料不使进入细胞内,当癌细胞膜死亡或细胞膜受损时,染料即进入细胞内,和细肥核结合,将其染成红色。红染率的高低反应了死癌细胞的多少。我们用以上实验方法,向生长腹水瘤5天的动物腹腔注入山蛩醇醚提取物0.2毫升(200亳克/公斤)一次,于注射前和注射后1、2、6、12、24小时，分别腹腔穿刺,无菌吸取腹水液0.1毫升中,室温下放置5分钟,取1滴于血球计数盘上,计数500个细胞,算出核红染的癌细胞比率。
结果发现,对照组腹水液的癌细胞红染率在2.3~4.3﹪之间波动,处理前和处理后1、2、6、12、24小时的红染率分别是2.3±0.5﹪和2.8±0.8、4.3±3.0、3.6±0.5、2.0±0.9、3.3±1.1﹪；给药组的红染率相应是2.4±0.5﹪和27.9±2.8、35.0±10.0、19.4±4.5、4.1±0.9、3.8±1.0﹪。
从上述结果可以看出,给药后1小时,癌细胞的红染率即显著升高,比给药前增高近10倍,作用持续至第6小时,同自体给药前的红染率相比,统计学上均有显著差异。应该说明,红染率的计算是以完整的细胞为基础,并不包括溶解、破碎的细胞。因此,药物引起癌细胞死亡的比例,实际上比这还要高
三、
对癌细胞膜的影响
红染率的实验提示,药物可引起癌细胞膜功能的损伤,为此,作了扫描电子显微镜观察。
将U14A癌细胞4~5×106个/只接种于昆明种小鼠腹腔,6天后,选择腹水瘤生长良好的动物,腹腔给山蛩醇醚提取物0.2毫升(200毫克/公斤)一次,在给药前和给药后0.5、1、2和3小时,分别穿刺吸取癌性腹水0.2毫升,用PH7.4的磷酸缓冲液洗涤3次,低速离心去上清液,在细胞沉淀中加入PH7.4磷酸缓冲液配制的1﹪戊二醛1毫升,3小时后,低速离心除戊二醛后,复用磷酸缓冲液洗涤3次,再用1﹪锇酸0.5毫升固定1小时,除去固定液后,复以磷酸缓冲液洗涤,依次通过10﹪、20﹪、40﹪、80﹪95﹪乙醇和无水酒精,稀释于丙酮,滴在铜片上,自然干燥、喷金后,扫描电镜观察,比较给药前和给药后不同时间的癌细胞表膜的变化。
观察到未给药的U14A癌细胞形状为圆形或椭圆形,细胞表面凹凸不平,未见有微突。
给药半小时后,癌细胞表面形态大部分与给药前的相同,但有的细胞体积增大,表面略呈突起状,向细胞质内的凹陷较未治疗的细胞大而深。给药一小时后,癌细胞表面呈连续的颗粒块状,以胞核部位较为突出,有的细胞表面有较粗的微突出现;同时,细胞表面的颗粒状结构明显。给药二小时后,细胞形态仍然呈圆形或椭圆形,大部分细胞较治疗前有些膨大,其表面呈颗粒状凸出,有的细胞在核的位置呈圆丘状隆起,细胞表面多有微突,有的微突互相连合,此微突的形态似毛状,较给药后1小时的癌细胞表面微突为细。给药后3小时,细胞大部分变形,微突消失,细胞表面颗粒状结构亦不明显;
有破裂后的细胞碎片。
这些现象表明,山蛩醇醚提取物能影响腹水癌细胞的膜结构,从而引起癌细胞的损伤和破坏。
四、对癌细胞有丝分裂的影响
肿瘤主要通过有丝分裂进行繁殖,癌细胞有丝分裂的高低,在某种程度上反应了肿瘤增殖的状态。用实验一的方法,向生长腹水瘤5天的动物腹腔注入山蛩醇醚提取物0.2毫升(200毫克/公斤)一次,于给药前和给药后1、2、6、12、24小时,穿刺腹腔,无菌吸取腹水液0.1毫升,涂片,Geimsa染色,每个动物计数500个细胞,算出正常在有丝分裂(从分裂前期到后期)的癌细胞比例。
结果发现,对照组腹水液的癌细胞有丝分裂在1.4~2.1﹪之间波动,处理前和处理后1、2、6、12、24小时的有丝分裂率分别是:1.84±0.21﹪和2.03±0.24、1.40±0.22、1.65±19、2.06±0.26、1.87±0.21﹪;给药组的有丝分裂率相应是1.85±0.15﹪和0.60±0.17、0.63±0.17、1.34±.019、1.31±0.61﹪。说明山蛩提取物能显著抑制U14A的有丝分裂。给药后一小时即呈现明显效果,给药后2小时作用最强,涂片中看不到分裂细胞;给药后6小时有丝分裂率有所回升,但明显低于对照组(p<0.05)。直至给药后24小时,有丝分裂率仍略低于给药前的水平。
五、 讨论
以上结果表明,山蛩的醇醚提取物与癌细胞作用后,在1小时以内,就能引起癌细胞膜改变,造成细胞核裂解和细胞崩毁、溶解。这种作用在给药后2小时为最强,可以持续6小时以上。由于药物与癌细胞直接接触,起效时间较短,推测癌细胞的损伤可能是药物直接作用于癌细胞的组分所致,其中尤以药物干扰膜和核的结构和功能的可能性较大。至于药物在癌细胞的微环境中达到多少浓度就能发挥效应,这是了解药物的实际运用和用药方祟、途径有关的重要问题,因我们的实验只用了一种药物剂量,不能对比作出回答,是今后需要进行研究的课题。
从植物中提取的抗癌物质如长春花碱等,常通过破坏纺锤体,使细胞分裂中止于中期,从而抑制细胞增殖而起作用。山蛩提取物能降低癌细胞的有丝分裂率,但并未见到仍何一种分裂期细胞积聚的现象,因此,它不问同于长春花碱类作用,可能是影响了与整个分裂机制相关的物质基础所致。
六、
小结
山蛩的醇醚提取物和癌细胞作用,能引起癌细胞膜改变,红染率提高,有丝分裂抑制,细胞核裂解,细胞崩毁、溶解,对癌细胞具有直接地损伤破坏作用。这种作用在单次给药后1小时起效,2小时达高峰,可持续6小时以上。
本文发表于《中医杂志》1980年笫六期第64
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