山蛩提取物对瘤细胞作用的观察

中国中医研究院中药研究所药理室肿瘤组

姜廷良 冯桂文 李兰芳 沈建华 傅湘琦

ABSTRACT

Mice with ascites U14 carcinoma were trated (ip. 200mg/kg for once only )with the extract of Spirobolus bungii Brandt. An increase in cancer cell death ratio of 35﹪ was seen at 2 hr . after treatment. The injured cells presented karyopyknosis, karyoclasis, cytoclasis and vacuolization. Tumor nitosis was immediately arrested. After up to 24 hr. of exposure, the ratio of mitosis fell below the starting level. Scanning electron microscopy also revealed significantchanges.

The plasma membrane of cancer cell appeared deepening of gap, increasing in small fingerilike processes and rising of large granules. The findings indicated that the extract had direct destructive effect on cancer cell.The activity happened at l hr. after single treatment and lasted for 6 hours.

我们观察到,山蛩(SPirobolus bungii Brandt.)提取物对小鼠某些实体瘤和腹水型移植性肿瘤生长有一定的抑制作用,特别对腹水型肿瘤,用对实体瘤有效剂量的1/4~1/6,甚则一次腹腔给药,就有显著抑制癌细胞增植和延长动物存活时间的作用,提示山蛩提取物对癌细胞可能具有直接损伤作用。为此，我们用组织学和扫描电镜方法,观察了它对癌细胞的作用。

一、 对癌细胞一般形态学的影响

用本院饲育的20~22克体重昆明种小鼠,雌雄不拘,腹腔接种活的腹水型移植性宫颈癌(U14A)细胞4~5×106个/只,5天后,选择腹水癌生长大体相同的动物,按体重随机分为2组,每组8~10只。给药组腹腔给予山蛩醇醚提取物0.2毫升(200毫克/公斤)一次,对照组给予等容量溶媒。在给药前和给药后第1、2、6和12小时,分别穿刺腹腔,用无菌注射器吸取腹水液0.1毫升,涂片,Geimsa染色,微镜检查观察。

给药前生长5天的癌性腹水涂片,视野中可见大量生长旺盛的癌细胞。癌细胞呈圆形或卵圆形,大小不均。胞浆嗜碱性较强,核大,约占整个细胞的3/4左右,染色深。可看到多核巨瘤细胞,细胞分裂相多见,偶可见中性粒细胞和大单核细胞。

给药后1小时,涂片上大量癌细胞形态发生改变：有些核基本正常的癌细胞膜,发生凸起;有些膜、浆基本保持正常的癌细胞核裂解,染色质呈球、块状，染色变浅;有些较少癌细胞则完全溶解。给药后2小时,涂片上满视野均为核裂解或完全溶解的癌细胞,很难找到“正常”的癌细胞。这种现象在给药后6小时的涂片上依然如此。给药后12小时,涂片上溶解的癌细胞己经基本消失,可见到较多的嗜中性粒细胞和大单核细胞,偶尔亦可发现个别残存的癌细胞。给溶媒的对照组小鼠,癌性腹水液涂片的细胞,无论在处理后1小时、2小时、6小时或12小时,均与处理前无明显差异。

结果提示,山蛩的醇醚提取物,可以损伤破坏癌细胞,使癌细胞核裂解、溶解,在给药后1小时即呈现明显作用,作用持续6小时以上。

二、 对癌细胞红染率的影响

癌细胞红染率是用活体染料伊红溶液观察癌细胞染色的情况。当活体癌细胞膜功能完整时,能排斥染料不使进入细胞内,当癌细胞膜死亡或细胞膜受损时,染料即进入细胞内,和细肥核结合,将其染成红色。红染率的高低反应了死癌细胞的多少。我们用以上实验方法,向生长腹水瘤5天的动物腹腔注入山蛩醇醚提取物0.2毫升(200亳克/公斤)一次,于注射前和注射后1、2、6、12、24小时，分别腹腔穿刺,无菌吸取腹水液0.1毫升中,室温下放置5分钟,取1滴于血球计数盘上,计数500个细胞,算出核红染的癌细胞比率。

结果发现,对照组腹水液的癌细胞红染率在2.3~4.3﹪之间波动,处理前和处理后1、2、6、12、24小时的红染率分别是2.3±0.5﹪和2.8±0.8、4.3±3.0、3.6±0.5、2.0±0.9、3.3±1.1﹪；给药组的红染率相应是2.4±0.5﹪和27.9±2.8、35.0±10.0、19.4±4.5、4.1±0.9、3.8±1.0﹪。

从上述结果可以看出,给药后1小时,癌细胞的红染率即显著升高,比给药前增高近10倍,作用持续至第6小时,同自体给药前的红染率相比,统计学上均有显著差异。应该说明,红染率的计算是以完整的细胞为基础,并不包括溶解、破碎的细胞。因此,药物引起癌细胞死亡的比例,实际上比这还要高.

三、 对癌细胞膜的影响

红染率的实验提示,药物可引起癌细胞膜功能的损伤,为此,作了扫描电子显微镜观察。

将U14A癌细胞4~5×106个/只接种于昆明种小鼠腹腔,6天后,选择腹水瘤生长良好的动物,腹腔给山蛩醇醚提取物0.2毫升(200毫克/公斤)一次,在给药前和给药后0.5、1、2和3小时,分别穿刺吸取癌性腹水0.2毫升,用PH7.4的磷酸缓冲液洗涤3次,低速离心去上清液,在细胞沉淀中加入PH7.4磷酸缓冲液配制的1﹪戊二醛1毫升,3小时后,低速离心除戊二醛后,复用磷酸缓冲液洗涤3次,再用1﹪锇酸0.5毫升固定1小时,除去固定液后,复以磷酸缓冲液洗涤,依次通过10﹪、20﹪、40﹪、80﹪95﹪乙醇和无水酒精,稀释于丙酮,滴在铜片上,自然干燥、喷金后,扫描电镜观察,比较给药前和给药后不同时间的癌细胞表膜的变化。

观察到未给药的U14A癌细胞形状为圆形或椭圆形,细胞表面凹凸不平,未见有微突。

给药半小时后,癌细胞表面形态大部分与给药前的相同,但有的细胞体积增大,表面略呈突起状,向细胞质内的凹陷较未治疗的细胞大而深。给药一小时后,癌细胞表面呈连续的颗粒块状,以胞核部位较为突出,有的细胞表面有较粗的微突出现;同时,细胞表面的颗粒状结构明显。给药二小时后,细胞形态仍然呈圆形或椭圆形,大部分细胞较治疗前有些膨大,其表面呈颗粒状凸出,有的细胞在核的位置呈圆丘状隆起,细胞表面多有微突,有的微突互相连合,此微突的形态似毛状,较给药后1小时的癌细胞表面微突为细。给药后3小时,细胞大部分变形,微突消失,细胞表面颗粒状结构亦不明显; 有破裂后的细胞碎片。

这些现象表明,山蛩醇醚提取物能影响腹水癌细胞的膜结构,从而引起癌细胞的损伤和破坏。

四、对癌细胞有丝分裂的影响

肿瘤主要通过有丝分裂进行繁殖,癌细胞有丝分裂的高低,在某种程度上反应了肿瘤增殖的状态。用实验一的方法,向生长腹水瘤5天的动物腹腔注入山蛩醇醚提取物0.2毫升(200毫克/公斤)一次,于给药前和给药后1、2、6、12、24小时,穿刺腹腔,无菌吸取腹水液0.1毫升,涂片,Geimsa染色,每个动物计数500个细胞,算出正常在有丝分裂(从分裂前期到后期)的癌细胞比例。

结果发现,对照组腹水液的癌细胞有丝分裂在1.4~2.1﹪之间波动,处理前和处理后1、2、6、12、24小时的有丝分裂率分别是:1.84±0.21﹪和2.03±0.24、1.40±0.22、1.65±19、2.06±0.26、1.87±0.21﹪;给药组的有丝分裂率相应是1.85±0.15﹪和0.60±0.17、0.63±0.17、1.34±.019、1.31±0.61﹪。说明山蛩提取物能显著抑制U14A的有丝分裂。给药后一小时即呈现明显效果,给药后2小时作用最强,涂片中看不到分裂细胞;给药后6小时有丝分裂率有所回升,但明显低于对照组(p<0.05)。直至给药后24小时,有丝分裂率仍略低于给药前的水平。

五、 讨论

以上结果表明,山蛩的醇醚提取物与癌细胞作用后,在1小时以内,就能引起癌细胞膜改变,造成细胞核裂解和细胞崩毁、溶解。这种作用在给药后2小时为最强,可以持续6小时以上。由于药物与癌细胞直接接触,起效时间较短,推测癌细胞的损伤可能是药物直接作用于癌细胞的组分所致,其中尤以药物干扰膜和核的结构和功能的可能性较大。至于药物在癌细胞的微环境中达到多少浓度就能发挥效应,这是了解药物的实际运用和用药方祟、途径有关的重要问题,因我们的实验只用了一种药物剂量,不能对比作出回答,是今后需要进行研究的课题。

从植物中提取的抗癌物质如长春花碱等,常通过破坏纺锤体,使细胞分裂中止于中期,从而抑制细胞增殖而起作用。山蛩提取物能降低癌细胞的有丝分裂率,但并未见到仍何一种分裂期细胞积聚的现象,因此,它不问同于长春花碱类作用,可能是影响了与整个分裂机制相关的物质基础所致。

六、 小结

山蛩的醇醚提取物和癌细胞作用,能引起癌细胞膜改变,红染率提高,有丝分裂抑制,细胞核裂解,细胞崩毁、溶解,对癌细胞具有直接地损伤破坏作用。这种作用在单次给药后1小时起效,2小时达高峰,可持续6小时以上。

本文发表于《中医杂志》1980年笫六期第64页